淺談臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)PCR實(shí)驗(yàn)室建設(shè)標(biāo)準(zhǔn)及配置

根據(jù)《臨床檢驗(yàn)擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理暫行辦法》，制定本標(biāo)準(zhǔn)
一、 臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室區(qū)域設(shè)置原則    
 （一） 臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室區(qū)域設(shè)置原則    
1、 試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)     
2、 標(biāo)本制備區(qū)
3、 擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)     
4、 擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)      
如使用全自動(dòng)分析儀，區(qū)域可適當(dāng)合并。      
（二）各工作區(qū)域必須有明確的標(biāo)記，避免不同工作區(qū)域內(nèi)的設(shè)備、物品混用。    
（三）進(jìn)入各工作區(qū)域必須嚴(yán)格按照單一方向進(jìn)行，即試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū) —>標(biāo)本制備區(qū)—>擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)—>擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。      
（四）不同的工作區(qū)域使用不同的工作服（例如不同的顏色）。工作人員離開(kāi)各工作區(qū)域時(shí)，不得將工作服帶出。     
二、 工作區(qū)域儀器設(shè)備配置標(biāo)準(zhǔn)    
 （一） 試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)     
1、2-8C和-15C冰箱     
2、混勻器      
3、微量加樣器（覆蓋1-1000ul）     
4、移動(dòng)紫外燈（近工作臺(tái)面）      
5、消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾心）    
 6、專用工作服和工作鞋    
 7、專用辦公用品     
（二） 標(biāo)本制備區(qū)     
 1、2-8C冰箱、-20C或-80C冰箱   
2、高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)     
3、混允器      
4、水浴箱或加熱模塊     
 5、微量加樣器（覆蓋1-1000ul）    
 6、可移動(dòng)紫外燈（近工作臺(tái)面）     
7、超凈工作臺(tái)      
8、消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾心）     
9、專用工作服和工作鞋     
10、專用辦公用品      
如需處理大分子DNA，應(yīng)具有超聲波水浴儀。    
（三） 擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)
 1、 核酸擴(kuò)增儀      
2、 微量加樣器（覆蓋1-1000ul）     
3、 可移動(dòng)紫外燈（近工作臺(tái)面）      
4、消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾心）     
5、 專用工作服和工作鞋     
6、 專用辦公用品     
(四)擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)      
視檢驗(yàn)方法不同而定?；緝x器設(shè)備如下：     
1、 微量加樣器（覆蓋1-1000ul）     
2、 可移動(dòng)紫外燈（近工作臺(tái)面）      
3、消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、加樣器吸頭（帶濾心）     
4、 專用工作服和工作鞋     
5、 專用辦公用品      
為了對(duì)以個(gè)特定序列進(jìn)行PCR做重復(fù)檢測(cè),需要三個(gè)不同的區(qū)域,每一個(gè)區(qū)域的具體技術(shù)操作和試劑在下面詳細(xì)列出.     
1、 樣品準(zhǔn)備區(qū)      
這個(gè)區(qū)域?qū)ｉT用作樣品的準(zhǔn)備，在制備和操作用于核酸提取的試劑時(shí)應(yīng)該采     
取預(yù)防措施：      
1）PCR產(chǎn)物和帶有要擴(kuò)增序列的DNA克隆不能在這個(gè)房間操作。     
 2）組織培養(yǎng)物、組織標(biāo)本和血清樣品都帶進(jìn)樣品準(zhǔn)備間處理，以根據(jù)應(yīng)用的需要提取DNA或RNA。      
3）用于樣品處理的工具不能被用作普通分子克隆的工具，也不能用作操作靶序列。     
4）DNA樣品應(yīng)該用有專門的防護(hù)或正壓活塞式移液管操作，以防止在吸取樣品時(shí)有氣溶膠遺留。      
5）大體積樣品應(yīng)該用單獨(dú)包裝的無(wú)菌一次性移液管吸取。      
6）管子打開(kāi)前都要簡(jiǎn)短離心以減少氣溶膠的產(chǎn)生，而且管子不能用力崩開(kāi)，這樣會(huì)產(chǎn)生氣溶膠。      
7）任何時(shí)候都應(yīng)該穿實(shí)驗(yàn)服和帶手套，手套要經(jīng)常更換，尤其在抽提過(guò)程中每一步之間都要更換。實(shí)驗(yàn)服要專門用于樣品準(zhǔn)備間，經(jīng)常清洗。     
2、樣品準(zhǔn)備和RNA-PCR
      RNA-PCR的額外步驟需要額外的樣品操作，這樣增加了樣品之間污染的機(jī)會(huì)。為了避免這一問(wèn)題，反轉(zhuǎn)錄一步可以在樣品準(zhǔn)備區(qū)進(jìn)行。在RNA-PCR中應(yīng)用UNG以防止污染的方法也有報(bào)道。     
3、前PCR區(qū)      
必須有專門用于準(zhǔn)備各種反應(yīng)的區(qū)域，這個(gè)區(qū)域必須保持干凈，而且沒(méi)有來(lái)自克隆和樣品準(zhǔn)備的污染。前PCR區(qū)必須要有試劑和準(zhǔn)備，特別是專門用于前PCR區(qū)的正壓活塞式移液管。      
4、PCR實(shí)驗(yàn)室試劑的操作      
1）所用的所有溶液都應(yīng)該沒(méi)有核酸和（或）核酸酶（DNase和RNase）污染。     
2）所有PCR試劑中使用的水都應(yīng)該是高質(zhì)量的－新鮮蒸餾的去離子水，用0.22μm過(guò)濾的，并且是高壓滅菌。      
3）在20℃到25℃貯存的試劑建議加點(diǎn)像疊氮鈉一類的抗微生物劑，在擴(kuò)增試劑或樣品制備試劑中加入0.025%的疊氮鈉不抑制擴(kuò)增反應(yīng)。     
4）所用試劑都應(yīng)該以大體積配制，實(shí)驗(yàn)一下看試劑是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量進(jìn)行貯存。      
5）所有試劑和樣品準(zhǔn)備過(guò)程中都要使用一次性滅菌的瓶子和管子。     
6）新配制的試劑在用于準(zhǔn)備新的標(biāo)本之前應(yīng)該加以檢驗(yàn)。      
7）樣品準(zhǔn)備和前PCR區(qū)所使用的移液管在不使用時(shí)都應(yīng)該小心保存。     
5、在前PCR區(qū)建立PCR混合物      
1）可以把即刻可用的“主混合物”溶液配好、分裝并保存在-20℃或4℃，在實(shí)驗(yàn)室只涉及到擴(kuò)增一種或少數(shù)幾種特異序列時(shí)這樣做很有用。      
2）如果你的實(shí)驗(yàn)室使用多套引物，以致于配制包括所有試劑的單一反應(yīng)混合物不夠經(jīng)濟(jì)，可以考慮分裝保存夠一天的PCR成分。      
3）作為一個(gè)規(guī)則，應(yīng)該保存一套陰性、弱陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性對(duì)照樣品來(lái)分析樣品配制和PCR前過(guò)程的效率和潔凈程度。而且，你也希望通過(guò)使用一個(gè)已知的弱陽(yáng)性樣品來(lái)驗(yàn)證你的樣品緩沖液以證明里面不含擴(kuò)增抑制物。      
4）陰性樣品要與每組樣品同時(shí)做，以分析是否存在樣品與樣品之間的污染以及是否存在PCR產(chǎn)物的污染，陰性對(duì)照應(yīng)該包括核酸以外的所有試劑。      
5）當(dāng)做陽(yáng)性對(duì)照時(shí)，有兩個(gè)理由決定了應(yīng)該使用最少數(shù)量的核酸。     
6）由于必須有對(duì)照反應(yīng)，對(duì)照模板的特點(diǎn)應(yīng)該予以考慮。
6、控制污染的方法      
已設(shè)計(jì)出很有力的酶學(xué)方法用來(lái)消除一種形式的污染—使用UNG，這一技術(shù)能有效地消除由PCR產(chǎn)物引起的污染。另一種控制污染的方法是使用紫外線，這種方法不能完全消除污染問(wèn)題，但可以將污染降低幾個(gè)數(shù)量級(jí)。     
7、PCR儀的位置     
8、后PCR區(qū)      
PCR完成以后，需要分析樣品并解釋數(shù)據(jù)，應(yīng)該留出一個(gè)專門用于反應(yīng)后處理樣品的地方。后PCR活動(dòng)中使用的所用試劑、一次性耗材和儀器都必須是專門用于這一目的，決不能把實(shí)驗(yàn)室這一區(qū)域的試劑或儀器用于任何前PCR活動(dòng)